UJI BATAS MIKROBA

I.          Tujuan

Mahasiswa dapat melakukan uji batas mikroba suatu produk

II.        Dasar Teori

Uji Batas Mikroba dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob viabel di dalam semua jenis perbekalan farmasi, mulai dari bahan baku hingga sediaan jadi, untuk mengyatakan perbekalan farmasi tersebut bebas dari spesies mikroba tertentu. Otomatisasi dapat digunakan sebagai pengganti uji yang akan disajikan, dengan ketentuan bahwa cara tersebut sudah divalidasi sedemikian rupa hingga menunjukkan hasil yang sama atau lebih baik. Selama menyiapkan dan melaksanakan pengujian, specimen harus ditangani secara aseptik. Jika tidak dinyatakan lain, jika disebut ”inkubasi”, maka yang dimaksud adalah menempatkan wadah di dalam ruangan terkendali secara termostatik pada suhu 30° dan 35° selama 24 jam sampai 48 jam. Istilah “tumbuh” ditunjukan untuk pengertian adanya dan kemungkinan adanya perkembangan mikrona viabel.

Uji Pendahuluan

Validasi hasil yang akan disajikan disini dalam banyak hal berdasarkan pada ketentuan yang menunjukkan bahwa spesimen uji tidak menghambat pertumbuhan mikroba yang terdapat dalam spesimen itu sendiri. Jadi sebagai uji pendahuluan dilakukan inokulasi secara terpisah enceran spesimen uji dengan biakan viabel yang terdiri dari Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Salmonella. Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1 ml dari tidak kurang enceran  biakan mikroba berumur 24 jam kepada enceran pertama spesimen uji (dalam dapar fosfat pH 7,2, Media Fluid Soybean-Casein Digest atau Media Fluid Lactose Medium dan uji sesuai prosedur. Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba di media bersangkutan, maka pengujian tersebut dinyatakan tidak berlaku dan diperlukan modifikasi prosedur dengan (1) meningkatkan volume pengencer dengan tetap mempertahankan bahan uji, atau (2) menambahkan zat inaktivator dengan jumlah secukupnya ke dalam pengencer, atau (3) suatu kombinasi modifikasi (1) dan (2) sedemikian rupa hingga terdapat pertumbuhan inokulum.

Bahan berikut ini adalah contoh dan konsentrasi zat yang ditambahkan ke dalam media untuk menetralkan zat penghambat yang terdapat di dalam contoh, yaitu lesitin kedele 0,5% dan polisorbat 204,0%. Sebagai alternatif, ulangi pengujian menggunakan Media Fluid Soybean-Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 untuk menunjukan netralisasi pengawet atau bahan antimikroba lainnya di dalam contoh. Jika zat penghambat terdapat di dalam sediaan dan dapat larut, dapat digunakan prosedur yang divalidasi dan sesuai seperti Prosedur uji menggunakan penyaringan membrane yang tertera pada Uji Sterilitas.

Jika penambahan inaktivator dan peningkatan volume seperti disebut di atas masih tidak dapat menunbuhkan mikroba viabel dan jika contoh tidak cocok tidak cocok diuji dengan cara penyaringan membrane, maka dapat disimpulkan bahwa kegagalan isolasi mikroba disebabkan oleh daya bakterisida dari sediaan. Informasi ini berguna untuk menunjukkan bahwa contoh tidak dapat dikontaminasi oleh jenis mikroba yang digunakan. Pemantauan perlu dilanjutkan untuk menetapkan besarnya daya hambat dan daya bakterisida dari bahan tersebut.

Larutan Dapar dan Media

Media biakan dapat dibuat seperti dibuat di bawah ini, atau media biakan dehidrat dapat digunakan jika sudah direkonstitusi sesuai petunjuk produsen atau distributor memiliki bahan yang sebanding dan/atau menghasilkan media yang sama dengan media yang menggunakan formula seperti disebut di bawah ini.

Peda pembuatan media menggunakan formula yang disebut di bawah ini, larutkan bahan padat yang dapat larut dalam air, jika perlu panaskan hingga larup sempurna, dan tambahkan larutan asam klorida atau natrium hidroksida secukupnya hingga diperoleh media dengan pH yang diinginkan, jika sudah siap digunakan. Tetapkan pH pada suhu 25° ± 2°.

Jika pada formula disebut agar, gunakan agar dengan kadar air tidak lebih dari 15% dan jika disebut air, gunakan Air Murni.

Larutan Dapar Posfat pH 7,2

Larutan 34g kalium posfat monobasa P dalam lebih kurang 500 ml air dalam labu terukur-1000 ml; tambahkan lebih kurang 175 ml natrium hidroksida 1 N hingga pH 7,2 ± 0,1. Tambahkan air sampai tanda, dan campur. Masukkan dalam beberapa wadah dan sterilkan. Simpan dalam lemari pendingin.

Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian larutan dengan 800 bagian air, dan sterilkan.

Media

Jika tidak dinyatakan lain, media harus disterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf (seperti yang tertera pada Sterilitas uap air dalam Sterilitas dan Jaminan Strerilitas Bahan Konfendia. Waktu paparan tergantung pada volume yang disterilkan.

Media FCDSLP (Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 Medium)

Digesti pankreatik kasein P  20      g

Lesitin kedele                     5     g

Polisorbat 20 P                   40   ml

Air                                          960           ml

Larutkan Digesti pankreatik kasein P dan Lesitin kedele di dalam tangas air pada suhu 48° sampai 50° selama lebih kurang 30 menit hingga larut. Tambahkan 40 ml Polisorbat 20 P, campur dan masukkan dalam wadah sesuai yang dikehendaki.

Media PCA (Plate Count Agar)

Yeast                                          2,5       g

Pancreatic digest of Casein            5          g

Glucose                                     1          g

Agar                                           15-20  g

Air Suling                                                1          L

Sebelum digunakan, sesaat sebelum dituang ke dalam cawan, terhadap media yang telah meleleh dan didinginkan hingga 45° pH diatur hingga 3,5 ± 0,1 menggunakan larutan asam ladrat P steril (1 dalam 10). Media dengan pH tidak boleh dipanaskan lagi

Prosedur

Spesimen yang akan diuji disiapkan sedemikian rupa sesuai dengan sifat fisiknya dan tidak mengubah jumlah dan jenis mikroba yang semula ada hingga diperoleh larutan atau suspensi dari semua atau sebagian spesimen dalam bentuk yang sesuai dengan prosedur uji yang akan dilaksankan.

Untuk bahan padat yang tidak seluruhnya melarut, perkecil ukuran bahan hingga merupakan serbuk cukup halus, suspensikan ke dalam pembawa tertentu, dan lakukan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.

Untuk spesimen cair yang terdiri atas larutan, suspense dalam air atau suatu larutan pembawa hidroalkoholik yang mengandung etanol kurang dari 30%, dan untuk bahan padat yang mudah larut dan praktis larus sempurna di dalam 90 ml dapar posfat pH 7,2 atau media tertentu, lakukan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.

Untuk cairan tidak campur air/salep, krim dan malam dibuat suatu suspensi dengan menggunakan emulgator steril yang sesuai dalam jumlah yang minimal (misalnya salah satu polisorbat), gunakan blender mekanik dan jika perlu hangatkan hingga suhu tidak lebih dari 45° san lanjutkan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.

Untuk spesimen cair dalam bentuk aerosol, dinginkan wadah dalam campuran alcohol dan es kering selama lebih kurang 1 jam, buka tutup wadah dan biarkan hingga mencapai suhu kamar, dan biarkan propelan terbebas, atau jika memungkinkan hangatkan wadah untuk mendorong propelan keluar. Pindahkan sejumlah tertentu bahan uji yang diperlukan untuk pengujian seperti yang tertera pada salah satu dari dua paragraph yang telah diutarakan sebelumnya. Jika hasil pengujian menggunakan residu. Jika ahasil pengujian menggunakan tidak dapat disimpulkan atau meragukan, ulangi pengujian dengan menggunakan 20 wadah atau lebih.

Angka Mikroba Aerob Total

Untuk spesimen yang cukup melarut atau transulen hingga dapat diuji dengan metode lempeng, gunakan cara tersebut; jika tidak gunakan Metode Tabung Ganda. Dengan menggunakan salah satu dari kedua cara tersebut, mula-mula larutkan atau suspensikan 10.0 g spesimen berbentuk padat, atau 10 ml spesimen berbentuk cair yang diukur saksama, di dalam dapar posfat pH 7,2, Media FSCD atau Media FCDSLP hingga diperoleh 100 ml. Untuk spesimen kentalyang pada pengenceran awal (1:10) tidak dapat dipipet, encerkan spesimen hingga diperoleh suspensi (1:50) atau (1:100), dan seterusnya hingga dapat dipipet. Lakukan pengujian untuk menetapkan tidak terdapatnya zat penghambat (zat antimikroba) seperti yang tertera pada Uji Pendahuluan, sebelum melakukan penetapan Angka Mikroba Aerob Total. Masukkan spesimen ke dalam media tidak lebih dari 1 jam setelah membuat enceran yang sesuai untuk inokulasi.

Terdapat dua metode yang dapat dilakukan untuk Uji Batas Mikroba, yaitu:

1.   Metode Lempeng

Metode ini dilakukan dengan cara inokulasi sediaan uji (specimen) dengan berbagai pengenceran pada media agar tertentu. Setelah inkubasi 48 samapai dengan 72 jam, pertumbuhan mikroba pada berbagai pengenceran diamati dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh.

Jika perlu encerkan cairan lebih lanjut sedemikian rupa hingga 1 ml diharapkan dapat menghasilkan 30 koloni sampai 300 koloni. Pipet 1 ml enceran akhir masing-masing ke dalam 2 cawan petri steril. Segera tambahkan ke dalam cawan 15 ml sampai 20 ml Media SCDA yang sebelumnya telah dicairkan dan didinginkan hingga lebih kurang 45°. Tutup cawan petri, campur contoh dan agar dengan cara memiringkan atau memutarnya, dan biarkan isi cawan memadat pada suhu kamar. Balikkan cawan dan inkubasi selama 48 jam hingga 72 jam. Setelah inkubasi, amati pertumbuhan di dalam lempeng, hitung jumlah koloni, dan dari kedua lempeng nyatakan rata-rata jumlah mikroba tiap g atau ml spesimen. Jika tidak ditemukan koloni mikroba di dalam cawan dengan enceran awal (1:10), nyatakan hasil pengujian sebagai: “kurang dari 10 mikroba per g atau ml spesimen”.

2.   Metode Tabung Ganda

Metode ini dilakukan dengan menggunakan beberapa tabung yang berisi media dan diinokulasikan dengan sediaan uji (spesimen) konsentrasi tertentu. Setelah diinkubasikan, amati adanya pertumbuhan mikroba pada setiap tabung. Jumlah mikroba yang tumbuh tiap g atau ml spesimen dihitung dari nilai duga terdekat/MPN (Most Probable Number) berdasarkan table MPN.

Ke dalam setiap tabung dari 14 tabung berukuran sama tambahkan mesing-masing 9,0 ml Media FSCD steril. Pisahkan 12 tabung dan bagi dalam 4 kelompok masing-masing terdiri dari 3 tabung. Satu kelompok sebagai control dan 3 kelompok lain sebagai: kelompok 1 (“100”), kelompok 2 (“10”), kelompok 3 (“1”), dan 2 tabung lainnya masing-masing dinyatakan sebagai tabung A dan tabung B. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 1 (“100”) dan tabung A dimasukkan 1ml larutan atau suspensi spesimen dan campur. Dari tabung A dipipet 1 ml ke tabung B, dan campur. Tabung A dan tabung B masing-masing akan berisi 100 mg (100 l) dan 10 mg (10 l) spesimen. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 2 (“10”) tambahkan 1 ml dari tabung A, ke dalam masing-masing tabung kelompok (“1”)  tambahkan 1 ml dari tabung B. Buang sisa isi dari tabung dan inkubasikan. Setelah diinkubasi, amati adanya pertumbuhan di dalam tabung, ketuga tabung control akan tetap jernih, dan berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan di kelompok 1, kelompok 2 dan kelompok 3, dan menggunakan acuan pada table, nyatakan Nilai Duga Terdekat (MPN) mikroba tiap g atau ml spesimen.

Sediaan Uji yang Digunakan

Merk                       :  Frestea Lemon

Netto                     :  500 ml

Komposisi             :  Air, Gula, Sari Buah Lemon, Konsentrat Teh, Pengatur Keasaman Asam Sitrat, Perisa Lemon & Cooling, Antioksidan Asam Askorbat.

Expired date       :  21 Januari 2011

Kode Produksi      :  BD3C 03:42

Diproduksi Oleh  :  PT. Coca-Cola Bottling Indonesia

Bekasi 17520 – Indonesia

Interpretasi hasil

Bila dari seluruh [etri tidak satu pun ynag menunjukkan jumlah antara 30 sampai dengan 300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai angka lempeng total perkiraan.

III.      Alat dan Bahan

1.   Alat

-       Cawan Petri

-       Tabung Reaksi

-       Labu Elenmeyer 250 ml

-       Pipet volum 10 ml

-       Pipet volum 1 ml

-       Labu ukur 100 ml

-       Coloni Counter

2.   Bahan

-       Media PCA

-       Garam Fisiologi

-       Aquadest steril

-       Sediaan Uji

IV.    Cara Kerja

a.  Siapkan 6 tabung reaksi steril, susun pada rak tabung. Masing-masing tabung secara berurutan diberi tanda  sebagai kode pengenceran dan tanggal pemeriksaan

b.  Siapkan pula 7 petri dish steril. Pada 6 petri dish diberi tanda di bagian belakangnya sesuai dengan kode pengenceran da tanggal pemeriksaan seperti pada butir a. Satu petri dish lainnya diberi tanda “kontrol”

c.   Pada Tabung kedua sampai dengan ke enam, diisi dengan 9 ml air garam phisiologis atau aquadest atau larutan garam buffer phosphate, untuk pemeriksaan Bacillus aureus harus menggunakan larutan garam buffer phosphate

d.  Kocok bahan spesimen 10 ml dengan 90 ml air garam fisiologis, atau aquadest steril, atau garam buffer phosphate pH 7,2 dalam labu elenmeyer. Ambil 10 ml masukkan pada tabung kesatu

e.   Pindahkan 1 ml bahan dari tabung kesatu ke dalam tabung kedua dengan pipet, cairan dibuat sampai homogen

f.     Pindahkan 1 ml bahan dari tabung kedua ke dalam tabung ketiga dengan pipet, cairan dibuat sampai homogen

g.  Demikian seterusnya hingga tabung keenam

h.   Dari masing-masing tabung, dimulai dari tabung keenam dengan menggunakan pipet steril, diambil 1 ml ke dalam masing-masing petri dish steril, sesuai dengan kode pengenceran yang sama

i.      Kemudian ke dalam masing-masing petri dish dituang media yang telah dipanaskan dalam tangas air ± 45° C sebanyak 15 – 20 ml. Masing-masing petri digoyang perlahan-lahanhingga tercampur merata dan biarkan hingga dingin membeku

j.      Masukkan ke dalam inkubator 37° C selama 2 x 24 jam dalam keadaan terbalik

k.    Kontrol dibuat dari cairan air garam phiologis atau aquadest atau larutan garam buffer phosphate, dimasukkan ke dalam petri dish “kontrol” dan dituangi media cair tersebut di atas sebanyak 15 – 20 ml

l.      Pembacaan dilakukan setelah 2 x 24 jam dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada setiap petri dish.

V.       Hasil Pengamatan

Tabel Hasil Pengamatan Uji Batas Mikroba

Cawan Petri	Gambar	Jumlah Koloni	Keterangan
		7	-
		9	-
		gagal	Daerah penyebaran terlalu besar
		8	-
		4	-
		7	-

Perhitungan :

Sesuai Interpretasi hasil, sampel yang digunakan adalah cawan petri  dengan jumlah mikroba 9 koloni, sehingga

 = 9 x  = 900 mikroba

VI.    Kesimpulan

Uji batas mikroba dapat menentukan apakah suatu produk memenuhi standar kandungan mikroba atau tidak.

Berdasarkan hasil pengamatan didapat kesimpulan bahwa the dengan merk frestea mengandung mikroba rata-rata sebanyak 900 atau 9 x . Dan masih memenuhi standar batas mikroba yang ditetapkan oleh BPOM, keterangan terlampir.

VII.  Daftar Pustaka

Departemen Kesehatan RI, 1995. Farmakope Indonesia, Edisi IV. Jakarta

Obat, Bio Farmasi, NAPZA, Kosalkes dan Obat Tradisional, BPOM Metode Analisis PPOMN 2001, Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan POM, Interpretasi Hasil Halaman 50

Ketentuan Standar Praktikum Mikrobiologi AKFAR Muhammadiyah Cirebon